Функциональная структура генов
Следующим важным этапом в изучении организации генетического материала было подразделение всех генов на два типа: регуляторные гены, т. е. гены, дающие информацию о строении регуляторных белков (репрессоров) и структурные гены, кодирующие строение остальных полипептидных цепей. Эта идея, а также ее экспериментальное доказательство были разработаны французскими исследователями Ф. Жакобом и Ж. Моно (1961) (см. ниже раздел "Регуляция генной активности").
Пользуясь этим методом, можно вывести заключение о функциональных единицах, участвующих в формировании данного признака. Сравнивая результаты, полученные в обоих случаях, с результатами экспериментов с мутациями в цис-положении, можно точно сказать, затронута ли мутацией одна и та же или же разные функциональные единицы. Данный метод позволил Бензеру охарактеризовать все обнаруженные им rII-мутанты и доказать, что они относятся к двум функциональным единицам. Сами единицы он назвал цистронами. Расчет показал, что в цистрон может входить около тысячи нуклеотидов.
Метод картирования мутаций с помощью делеций различной длины по Бензеру (1961): А - генетическая карта фага Т4 с указанием отдельных генов; Б - использование семи больших делеций (так называемые 'замечательные делеций') для выделения большого сегмента, заключающего искомую мутацию; В - дальнейшее ограничение области, заключающей мутацию, в пределах более мелкого сегмента; Г - дальнейшее сужение области, заключающей мутацию, с помощью менее протяженных мутаций; Д - точное картирование мутаций, попавших в сегмент А5с2а2, с помощью рекомбинационного анализа (методом трехфакторного скрещивания)
Генетическая карта спонтанных rII мутаций, выделенных и картированных С. Бензером (1963). Каждый квадратик представляет собой отдельный мутант
Если же мутации принадлежат двум разным функциональным единицам, то на первой хромосоме будет работать не затронутая мутацией вторая функциональная единица, а на второй хромосоме будет работать нормальная первая функциональная единица:
Оставалось выяснить, что представляет собой на молекулярном уровне третья характеристика гена - управление одной функцией. Для решения этого вопроса Бензер воспользовался ранее разработанным цис-транстестом, применив его к вирусам. Этот метод состоит в следующем. Требуется узнать, одинаковые или разные функциональные единицы затронуты у двух мутантов. Для этого первый раз мутации используются в транс-положении, т. е. когда каждая из них расположена в разных гомологичных хромосомах, а второй раз - в цис-положении, когда обе находятся в одной гомологичной хромосоме и вторая при этом нормальна. Если при транс-положении обе мутации принадлежат одной функциональной единице, то эти единицы в обеих хромосомах будут повреждены. Указанные явления могут быть проиллюстрированы при помощи таблиц, заимствованных из работ Бензера (см. стр. 476 и 477).
Установив факт существования точечных мутаций, Бензер задался целью определить минимальную длину участка ДНК, передаваемую при рекомбинации. Оказалось, что эта величина составляет не более нескольких нуклеотидов, т. е. нескольких мономеров полимерной молекулы ДНК. Бензер назвал эту величину реконом. В дальнейшем Ч. Яновский (1964) показал, что рекомбинации могут происходить между смежными парами нуклеотидов в цепях ДНК. Следующим этапом было установление минимальной длины участка, изменения которого достаточно для возникновения мутации, иными словами, определение минимального размера точечной мутации (мутона). По мнению Бензера, эта величина равна нескольким нуклеотидам. Однако последующими тщательными определениями было выявлено, что длина одного мутона не превышает размеров одного нуклеотида.
Имея набор делеций, отражающих выпадение участков молекулы ДНК, имеющих разную длину, Бензер пользовался ими как своеобразными линейками для определения локализации картируемого гена.
Среди различных внутригенных мутаций Бензер выделил два класса: точечные мутации (мутации минимальной протяженности) и делеции (мутации, занимающие достаточно широкую область гена). Одно из предположений о природе делеций (нехваток) основывалось на признании возможности выпадения последовательности нуклеотидов в молекуле той или иной длины. То, что делеции на самом деле обусловлены выпадением участков ДНК, было доказано впоследствии различными способами (Е. Буржи, В. Шибальский и др.). Если в классической генетике считалось, что делеции могут возникать только на хромосомном уровне, то теперь стало ясно, что такие мутации существуют и на внутригенном уровне. Кстати, именно делеции и позволили Бензеру резко ускорить процесс картирования мутаций.
Выделив несколько сотен rII-мутантов, Бензер для построения генетических карт предпринял всевозможные скрещивания их между собой. Основой для картирования служил широко применяемый в классической (а теперь и в молекулярной) генетике метод трехфакторного скрещивания (метод трех точек). В результате Бензеру удалось с большой точностью расположить в пределах одного rII-гена несколько сотен различных мутаций.
Бензер разработал удобный тест для разделения r-мутантов на три группы (rI, rII и rШ) по способности образовывать бляшки определенной формы на различных линиях Е. coli. В частности, те r-мутанты, которые дают большие, круглые, прозрачные бляшки на линии Е. coli В и не дают бляшек вовсе на Е. coli K12 (λ), являются rII-мутантами. Очевидно, это позволяет предельно просто выделять из популяции rII фагов все обратные мутанты, т. е. восстановившие свою способность лизировать клетки Е. coli K12 (λ).
* (В молекулярной генетике вместо термина "кроссинговер" принят термин "рекомбинация", который все чаще начинают использовать и в генетике высших организмов.)
Одно из наиболее существенных достижений молекулярной генетики заключалось в установлении минимальных размеров участков гена, передающихся при кроссинговере*, подвергающихся мутации и осуществляющих одну фракцию. Оценки этих величин были получены в 50-е годы С. Бензером при изучении так называемых rII-мутаций бактериофага Т4, поражающего кишечную палочку - Е. coli. Эти мутанты дают быстро формирующиеся негативные колонии (бляшки) на бактериальном газоне (отсюда и происхождение термина r-мутанты - от английского слова rapidly).
Тонкая структура гена
В послевоенные годы эти исследования получили широкий размах и проводятся на самых различных биологических объектах.
В 1941 г. Дж. Бидл и Э. Тейтум опубликовали короткую статью "Генетический контроль биохимических реакций у Neurospora", в которой сообщили о первых генетических экспериментах на микроорганизмах (см. об этом в главе 7).
Исследователями классического периода развития генетики были выяснены основные закономерности наследования и доказано, что наследственные факторы (гены) сосредоточены в хромосомах. Дальнейший прогресс в изучении закономерностей хранения и реализации генетической информации сдерживался по двум причинам. Во-первых, из-за слишком объемных экспериментов, связанных с более глубоким изучением генов, во-вторых, ввиду невозможности понять работу генов без углубленного исследования превращения молекул, вовлеченных в генетические процессы. Достаточно напомнить, например, что для установления дробимости гена исследователям понадобилось только в одном эксперименте просмотреть несколько сотен тысяч дрозофил. Поэтому переход к генетическим исследованиям микроорганизмов, позволивший избежать указанных трудностей, был вполне закономерен. Такой переход к изучению генетических закономерностей на молекулярном уровне осуществился в 50-х годах.
Глава 24. Молекулярная генетика. (В. Н. Сойфер)
Глава 24. Молекулярная генетика. (В. Н. Сойфер) [1975 - - История биологии. С начала XX века до наших дней]
